Immune challenges upregulate the expression of cannabinoid receptors in cultured human odontoblasts and gingival fibroblasts / Los desafíos inmunológicos regulan la expresión de los receptores cannabinoides en cultivos de odontoblastos y fibroblastos gingivales humanos

ABSTRACT Odontoblasts and gingival fibroblasts play essential roles in the physiological and pathological processes of dental tissue. Cannabinoid receptors (CB1 and CB2) are involved in analgesia by modulating the función of calcium channels that inhibit the synthesis of some neurotransmitters. A better understanding of the physiology of these receptors would provide the possibility of using them as therapeutic targets in controlling dental pain. The aim of this study was to evaluate the presence and activity of cannabinoid receptors in human odontoblast-like cells (OLC) and human gingival fibroblasts (HGF). CB1 and CB2 transcription was analyzed by real-time PCR, proteins were detected by immunofluorescence, and functional cannabinoid receptors were evaluated by measuring intracellular calcium concentration after stimulation with cannabidiol (CBD) and pre-treatment with a CB1 antagonist, a CB2 inverse agonist and a TRPV1 antagonist. Transcripts for CB1 and CB2 were found in both odontoblasts and gingival fibroblasts. Cannabidiol induced an increase in [Ca2+]i in both cells types, but surprisingly, pre-treatment with selective cannabinoid antagonists attenuated this effect, suggesting a functional communication between specific cannabinoid receptors and other CBD target receptors. In conclusion, human odontoblasts and gingival fibroblasts express functional CB1 and CB2 cannabinoid receptors, which could be modulated to improve the treatment of pain or dental sensitivity.

RESUMEN Los odontoblastos y los fibroblastos gingivales desempeñan funciones esenciales en los procesos fisiológicos y patológicos de los tejidos dentales. Los receptores cannabinoides (CB1 y CB2) participan en la analgesia mediante la modulación de la función de canales de calcio que inhiben la síntesis de algunos neurotransmisores. Un mejor conocimiento de su fisiología abre la posibilidad de utilizar estos receptores como dianas terapéuticas en el control del dolor dental. Este trabajo tuvo como objetivo evaluar la presencia y la actividad de los receptores cannabinoides en células humanas similares a los odontoblastos (OLC) y en fibroblastos gingivales humanos (HGF). Se analizó la transcripción de CB1 y CB2 por PCR en tiempo real, la detección de las proteínas por inmunofluorescencia y se evaluaron los receptores cannabinoides funcionales midiendo las concentraciones de calcio intracelular, tras la estimulación con cannabidiol (CBD) y el pretratamiento con un antagonista de CB1, un agonista inverso de CB2 y un antagonista de TRPV1. Se encontraron mensajeros para CB1 y CB2 tanto en odontoblastos como en fibroblastos gingivales. El cannabidiol indujo un aumento de la [Ca2+]i en ambos tipos de células, pero sorprendentemente el pretratamiento con antagonistas cannabinoides selectivos atenuó este efecto, lo que sugiere una comunicación funcional entre receptores cannabinoides específicos y otros receptores diana del CBD. En conclusión, los odontoblastos humanos y los fibroblastos gingivales expresan receptores cannabinoides CB1 y CB2 funcionales, que podrían ser modulados para mejorar el tratamiento del dolor o la sensibilidad dental.

Differential replicative fitness of the four dengue virus serotypes circulating in Colombia in human liver Huh7 cells

ABSTRACT Dengue has been a significant public health problem in Colombia since the simultaneous circulation of the four dengue virus serotypes. The replicative fitness of dengue is a biological feature important for virus evolution and contributes to elucidating the behavior of virus populations and viral pathogenesis. However, it has not yet been studied in Colombian isolates. This study aimed to compare the replicative fitness of the four dengue virus serotypes and understand the association between the serotypes, their in vitro infection ability, and their replication in target cells. We used three isolates of each DENV serotype to infect Huh-7 cells at an MOI of 0.5. The percentage of infected cells was evaluated by flow cytometry, cell viability was evaluated by MTT assay, and the pathogenicity index was calculated as a ratio of both parameters. The replicative fitness was measured by the number of viral genome copies produced using quantitative PCR and the production of infectious viral progeny was measured by plaque assay. We showed that Huh-7 cells were susceptible to infection with all the different strain isolates. Nevertheless, the biological characteristics, such as infectious ability and cell viability, were strain-dependent. We also found different degrees of pathogenicity between strains of the four serotypes, representative of the heterogeneity displayed in the circulating population. When we analyzed the replicative fitness using the mean values obtained from RT-qPCR and plaque assay for the different strains, we found serotype-dependent behavior. The highest mean values of replicative fitness were obtained for DENV-1 (log 4.9 PFU/ml) and DENV-4 (log 5.28 PFU/ml), followed by DENV-2 (log 3.9 PFU/ml) and DENV-3 (log 4.31 PFU/ml). The internal heterogeneity of the replicative fitness within each serotype could explain the simultaneous circulation of the four DENV serotypes in Colombia.

Anticuerpos policlonales contra la proteína recombinante NS3 del virus del dengue / Polyclonal antibodies against recombinant dengue virus NS3 protein

Resumen Introducción: El dengue es una enfermedad causada por uno de los cuatro serotipos del virus del dengue (DENV) y es endémica en, aproximadamente, 130 países. Su incidencia ha aumentado notablemente en las últimas décadas, así como la frecuencia y la magnitud de los brotes. A pesar de los esfuerzos, no existen tratamientos profilácticos ni terapéuticos contra la enfermedad y, en ese contexto, el estudio de los procesos que gobiernan el ciclo de infección del DENV es esencial para desarrollar vacunas o terapias antivirales. Una de las moléculas del DENV más prometedoras es la proteína no estructural 3 (NS3), la cual es indispensable para la replicación viral y es uno de los principales blancos inmunológicos durante la infección. Objetivo: Producir anticuerpos policlonales para contribuir a los futuros estudios sobre las interacciones entre la proteína NS3 y otras proteínas celulares. Materiales y métodos: Se expresaron dos proteínas recombinantes del dominio helicasa de NS3 del DENV de serotipo 2, las cuales se emplearon para inmunizar ratas y producir anticuerpos policlonales. Resultados: Los anticuerpos producidos fueron útiles en ensayos de Western blot e inmunofluorescencia y se reportó por primera vez un anticuerpo policlonal anti-NS3 que permitió la inmunoprecipitación de la proteína viral y la detecta con Western blot sin necesidad de inducir sobreexpresión de NS3 o de usar extractos de células marcados metabólicamente con radioisótopos. Conclusión: Las proteínas recombinantes expresadas y los anticuerpos producidos constituyen herramientas valiosas para estudiar procesos infecciosos del DENV que involucren a la proteína NS3 y evaluar pruebas dirigidas a interferir las funciones de esta proteína.

Abstract Introduction: Dengue is a disease caused by one of four serotypes of the dengue virus (DENV) and is endemic in approximately 130 countries. The incidence of dengue has increased dramatically in recent decades, as well as the frequency and magnitude of outbreaks. Despite all efforts, there are no prophylactic or therapeutic treatments for the disease. Accordingly, research on the processes governing the DENV infection cycle is essential to develop vaccines or antiviral therapies. One of the most attractive DENV molecules to investigate is nonstructural protein 3 (NS3), which is essential for viral replication and a major immune target for infection. Objective: To produce antibodies to support future studies on NS3 and its cellular interactions with other proteins. Materials and methods: Two recombinant proteins of the helicase domain of DENV NS3 serotype 2 were expressed, and used to immunize mice and produce polyclonal antibodies. Results: The antibodies produced were useful in Western blot and immunofluorescence tests. We report an NS3 antibody that immunoprecipitates the viral protein and detects it in Western blot with no need to over-express it or use cell extracts with metabolic radiolabeling.

Description of an in vivo oral mucosa HSV-1 infection model in mice

In this work, we established an in vivo murine model of herpes simplex virus type 1 (HSV1) infection involving inoculation by scarification of the oral mucosain order to study its dissemination towards the trigeminal ganglion (TG). Both viral DNA and infectious virions were detected on the third day postinfection (p.i.). Viral proteins revealed by immunohistochemistry were mainly found at seven days p.i., when the latencyassociated transcript (LAT) was also detected. This model simulated the dissemination process of HSV1, which could be used to study herpes pathogenesis starting in the oral mucosa (AU)

Con el propósito de estudiar la dispersión de del Herpes Simplex Virus tipo 1 (HSV1) desde la mucosa oral hasta los ganglios trigeminales, en el presente trabajo se estableció un modelo de infección en ratones, haciendo inoculación por escarificación en la mucosa oral. Tanto ADN viral como viriones infecciosos se detectaron en los ganglios trigeminales al dia 3 postinfección (p.i.). Las proteínas virales se detectaron principalmente al día 7 p.i. cuando los transcritos asociados a latencia también fueron encontrados. El modelo de infección simula adecuadamente el proceso de dispersión del HSV1 y puede ser usado para el estudio de la patogénesis por herpes después de la infección primaria en la mucosa oral (AU)

Diagnóstico diferencial de dengue y chikungunya en pacientes pediátricos / Dengue and Chikungunya differential diagnosis in pediatric patients

Introducción. Las infecciones por el virus del dengue y del chikungunya presentan síntomas clínicos similares, lo cual dificulta el diagnóstico clínico. Además, son transmitidas por los mismos vectores, por lo que en una región puede haber circulación e infección simultánea con los dos virus. Los resultados de cada enfermedad, no obstante, son diferentes: la fiebre del chikungunya rara vez es fatal, pero puede dejar secuelas de tipo articular y neurológico, en tanto que el dengue es potencialmente fatal. De ahí la importancia de un diagnóstico preciso y oportuno. Objetivo. Comparar el diagnóstico presuntivo basado en los hallazgos clínicos con el diagnóstico diferencial hecho mediante pruebas de laboratorio. Materiales y métodos. Se utilizaron pruebas virológicas y serológicas específicas para dengue y chikungunya en ocho muestras de sangre de pacientes pediátricos con síndrome febril. Se empleó la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa para detectar los virus del dengue y del chikungunya y el método de ELISA basado en la captura de IgM para confirmar los casos de dengue. Resultados. Con base en los hallazgos clínicos, dos pacientes se clasificaron como casos probables de dengue o chikungunya, dos como casos probables de chikungunya y en cuatro no hubo diagnóstico presuntivo de infección viral. Las pruebas de laboratorio confirmaron la infección por el virus del dengue en dos pacientes, por el virus del chikungunya en otros dos e infección simultánea de dengue y chikungunya en los cuatro restantes. Conclusión. Los hallazgos clínicos no fueron suficientes para hacer un diagnóstico en pacientes pediátricos con síndrome febril, por lo cual se requirieron pruebas específicas de laboratorio para establecer con precisión el agente etiológico causante de la enfermedad.

Introduction: Dengue and Chikungunya infections have similar clinical symptoms, which makes their clinical diagnosis complex. Moreover, both are transmitted by the same mosquito vectors, which results in virus co-circulation and co-infection. However, the outcome of these diseases differs: Chikungunya fever is rarely fatal but can have permanent and severe rheumatic and neurological sequelae, whereas dengue disease is potentially fatal. Thus, accurate diagnosis is critical. Objective: To compare presumptive diagnoses based on clinical findings with the differential diagnoses based on specific laboratory tests for each virus. Materials and methods: We performed specific virological and serological tests for both dengue and Chikungunya infections on eight acute-phase blood samples collected from pediatric patients with febrile syndrome. We used RT-PCR to detect dengue and Chikungunya virus, and IgM-capture ELISA to confirm infection by dengue virus. Results: Based on clinical findings, two patients were diagnosed as probable cases of dengue or Chikungunya, and two were diagnosed as probable cases of chikungunya. Four had no presumptive diagnosis of viral infection. Laboratory tests confirmed dengue infection in two patients, Chikungunya infection in two patients, and co-infection by the two viruses in the other four patients. Conclusion: Clinical findings were not sufficient to make a diagnosis in pediatric patients with febrile syndrome; specific laboratory tests were required to establish the etiologic agent of the disease.

La infección con el virus del dengue induce apoptosis en células del neuroblastoma humano SH-SY5Y / Dengue virus induces apoptosis in SH-SY5Y human neuroblastoma cells

Introducción. El dengue es una enfermedad humana producida por el virus del mismo nombre, que se transmite por la picadura de mosquitos del género Aedes . La infección tiene una amplia gama de presentaciones clínicas que van desde la ausencia de síntomas hasta los casos fatales y afecta principalmente a la población pediátrica. Según la nueva clasificación de la enfermedad, las manifestaciones neurológicas se consideran un criterio para el diagnóstico del dengue grave. Objetivo. Evaluar los posibles mecanismos involucrados en la aparición de los signos neurológicos en una línea celular de neuronas humanas, como modelo de infección con el virus del dengue del serotipo 2 (DENV-2). Materiales y métodos. Se evaluó la sensibilidad y la permisividad de la línea celular SH-SY5Y a la infección por el DENV-2; se encontró que la proporción entre infección y producción viral era similar a las de las células de primates usadas como control positivo de la infección. Resultados. La infección indujo un efecto citopático en la línea celular de neuroblastoma caracterizado por un proceso de muerte apoptótica, con aumento en la proporción de células positivas al emplear los métodos de anexina V y TUNEL. Se encontró una regulación positiva del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), y el tratamiento con un anticuerpo anti-TNF-α aumentó ligeramente la supervivencia de las células infectadas. La adición de TNF-α exógeno a los cultivos infectados potenció la muerte celular. Conclusión. Estos resultados sugieren, en su conjunto, que la regulación positiva del TNF-α podría hacer parte del proceso que induce daño y muerte celular durante el desarrollo de la encefalitis por dengue.

Introduction: Dengue is a human disease caused by a virus with the same name, which is transmitted by the bite of Aedes mosquitoes. The infection has a wide range of clinical presentations ranging from asymptomatic to fatal cases, with the pediatric population being the most susceptible. According to the new classification of the disease, the neurological manifestations are considered a criterion for the diagnosis of severe dengue. Objective: To evaluate the possible mechanisms involved in the onset of neurological signs in a cell line of human neurons as a model of infection with dengue virus type 2 (DENV-2). Materials and methods: Susceptibility and permissiveness of the SH-SY5Y line to infection by DENV-2 was analyzed, showing that the proportions of viral infection and production are similar to those of primate cells used as positive control for infection. Results: Infection induced a cytopathic effect on the neuroblastoma line characterized by apoptotic cell death process, increasing the proportion of annexin V and TUNEL positive cells and an upregulation of TNF- α . Treatment with anti-TNF- α antibody increased slightly cell survival of infected cells. The addition of exogenous TNF- α to the infected cultures enhanced cell death. Conclusion: These results as a whole suggest that the upregulation of TNF- α could be part of the process that induces cell damage and death in cases of dengue encephalitis.

Descarga de HSV-1, HSV-2, CMV y EBV en la saliva de receptores de trasplante de precursores hematopoyéticos de la Fundación HOMI - Hospital de la Misericordia, Bogotá, DC / Shedding of HSV-1, HSV-2, CMV, and EBV in the saliva of hematopoietic stem cell transplant recipients at Fundación HOMI - Hospital de la Misericordia, Bogotá, DC

Introducción. El trasplante de precursores hematopoyéticos es una alternativa en el tratamiento de diversas condiciones en la población pediátrica. La intensidad del acondicionamiento para el trasplante predispone al desarrollo de complicaciones en los receptores. Las infecciones por el virus herpes simple 1 (HSV-1), el virus herpes simple 2 (HSV-2), el citomegalovirus (CMV) humano y el virus de Epstein-Barr (EBV) son una causa importante de morbimortalidad en estos pacientes. La reactivación de infecciones latentes puede producir descargas virales asintomáticas detectables en la saliva, lo cual ayuda a determinar el comportamiento de dichas infecciones en pacientes con trasplante y a establecer el diagnóstico temprano de la reactivación. Objetivo. Evaluar el comportamiento de la descarga viral de HSV-1, HSV-2, CMV y EBV en la saliva de pacientes hospitalizados en la Unidad de Trasplante de la Fundación HOMI - Hospital de la Misericordia, entre enero y noviembre de 2012. Materiales y métodos. Se evaluaron muestras de saliva de 17 receptores de trasplante. La presencia de ADN de HSV-1, HSV-2, CMV y EBV en las muestras de saliva se detectó mediante reacción en cadena de la polimerasa convencional. Resultados. Se detectó el ADN del HSV-2 en la saliva de cuatro pacientes, del CMV en la de cuatro y del EBV en la de nueve, lo cual se asoció con leucopenia. Cuatro de los 17 pacientes presentaron cargas simultáneas de CMV y EBV. No se detectó el ADN del HSV-1. Conclusiones: Se demostró una descarga asintomática de HSV-2, CMV y EBV asociada a leucopenia en la saliva de los pacientes.

Introduction: Hematopoietic stem cell transplantation in pediatric patients is an alternative treatment for different diseases. The conditioning regimen for transplant predisposes recipients to the development of infections. Viral infections by herpes simplex virus 1 (HSV-1), herpes simplex virus 2 (HSV-2), human cytomegalovirus (CMV), and Epstein-Barr virus (EBV), are the most common, and the leading cause of morbidity and mortality among these patients. These viruses lie dormant in various cell types and the reactivation of latent infections may lead to asymptomatic viral shedding in saliva. The detection of these viruses in secretions may contribute to understand the behavioral dynamics of these viral infections in transplanted patients, and to the early diagnosis of reactivation. Objective: To assess HSV-1, HSV-2, CMV and EBV viral shedding in the saliva of patients admitted for hematopoietic stem cell transplantation at Fundación HOMI - Hospital de la Misericordia between January and November of 2012. Materials and methods: We evaluated stimulated saliva samples of 17 hematopoietic stem cell transplantation recipients weekly. We performed DNA extraction from saliva, and we evaluated the presence of DNA for HSV-1, HSV-2, CMV, and EBV by PCR. Results: While we detected HSV-2 and CMV DNA in the saliva of four patients, EBV DNA was detected in nine patients with leukopenia. In contrast, we did not detect HSV-1 DNA in saliva. Additionally, four out of the 17 patients showed a simultaneous shedding of CMV and EBV. Conclusions: By conventional PCR, we demonstrated asymptomatic HSV-2, CMV, and EBV viral shedding in saliva, associated with leukopenia.

Detection of all four dengue serotypes in Aedes aegypti female mosquitoes collected in a rural area in Colombia

The Aedes aegypti vector for dengue virus (DENV) has been reported in urban and periurban areas. The information about DENV circulation in mosquitoes in Colombian rural areas is limited, so we aimed to evaluate the presence of DENV in Ae. aegypti females caught in rural locations of two Colombian municipalities, Anapoima and La Mesa. Mosquitoes from 497 rural households in 44 different rural settlements were collected. Pools of about 20 Ae. aegypti females were processed for DENV serotype detection. DENV in mosquitoes was detected in 74% of the analysed settlements with a pool positivity rate of 62%. The estimated individual mosquito infection rate was 4.12% and the minimum infection rate was 33.3/1,000 mosquitoes. All four serotypes were detected; the most frequent being DENV-2 (50%) and DENV-1 (35%). Two-three serotypes were detected simultaneously in separate pools. This is the first report on the co-occurrence of natural DENV infection of mosquitoes in Colombian rural areas. The findings are important for understanding dengue transmission and planning control strategies. A potential latent virus reservoir in rural areas could spill over to urban areas during population movements. Detecting DENV in wild-caught adult mosquitoes should be included in the development of dengue epidemic forecasting models.

Alta correlación en la detección de anticuerpos y antígenos de virus del dengue en muestras de suero y plasma / High correlation in dengue antibodies and antigen detection using serum or plasma samples

Introducción. El diagnóstico adecuado de dengue por laboratorio es importante para la atención, así como para el control de brotes y epidemias. Hasta el momento, las pruebas ELISA para diagnóstico serológico de la infección se encuentran validadas en muestras de suero; sin embargo, en algunas ocasiones la cantidad o calidad de la muestra es inadecuada, o solo se tiene acceso a sangre anticoagulada tomada para el análisis de los parámetros hematológicos en el hemograma. Objetivo. Evaluar el desempeño de cuatro pruebas ELISA en muestras de suero y plasma de casos sospechosos de dengue. Materiales y métodos. Se procesaron 42 muestras -21 de suero y 21 de plasma- por las técnicas de ELISA de captura para IgM, ELISA de captura para IgG, ELISA indirecta para IgG y ELISA para la detección del antígeno viral NS1. Resultados. El porcentaje de muestras positivas encontrado fue IgM 33.3%, IgG Captura 33.3%, IgG Indirecta 90.5%, NS1 23.8%. El 42.9% de las muestras fueron positivas por RT-PCR (n=9). Todas las pruebas se comportaron igual tanto en sueros como plasmas (coeficiente Kappa 1.0). Conclusión. Los resultados obtenidos muestran una alta concordancia entre las mediciones realizadas en suero y en plasma, lo cual sugiere que la muestra de plasma puede utilizarse para el diagnóstico y la confirmación de los casos de dengue.

Introduction. Appropriate dengue laboratory diagnosis is an important tool to manage the disease, as well to control possible outbreaks. Currently, ELISA dengue serological tests are validated to use with serum, however sometimes samples quality or quantity is inappropriate or there is only availability of anti-coagulated blood samples which have been used in total blood tests -haemogram-. Objective. To assess the performance of four dengue ELISA tests in serum or plasma samples obtained from presumptive dengue cases. Methodology. Forty two samples, 21 of serum and plasma each, were processed to dengue Capture IgM ultramicro-ELISA, Capture IgG ELISA, Indirect IgG ELISA and NS1 antigen ELISA. Nine out of 21 patients were diagnosed as dengue cases following the diagnostic algorithm. Results. The percentage of positive samples found was Capture IgM 33.3%, Capture IgG 33.3%, Indirect IgG 90.5% and NS1 dengue antigen 23.8%. Comparing the results between all ELISA tests it can be said that they had similar performances both in serum and plasma, the Kappa coefficient obtained was 1.0. Conclusions. These results show a high concordance between the measurements carried out in serum and plasma, which leads to suggest the latter may be used as a tool in the diagnosis and confirmation of dengue cases.

Aislamiento de metapneumovirus humano (HMPV) a partir de muestras clínicas / Human metapneumovirus isolation using clinical respiratory samples

Objetivo: El objetivo de este trabajo fue establecer una metodología para el aislamiento de una cepa de hMPV a partir de hisopados nasales provenientes de pacientes con sintomatología de enfermedad respiratoria aguda. Materiales y métodos: A partir de 12 muestras positivas por fluorescencia para hMPV, se hizo la inoculación en células LLCMK2 (epiteliales de riñón de mono Rhesus) con un medio de mantenimiento que contenía tripsina como proteasa. Se evaluó el efecto citopático diario por 10 días y se tomaron células infectadas que se utilizaron para la prueba de fluorescencia y para confirmar la infección. Se utilizó RT-PCR para corroborar la presencia del virus. Resultados: En 8 de las 12 muestras procesadas, se logró aislar el hMPV, confirmándose la infección por fluorescencia y RT-PCR. Conclusiones: A pesar de ser un virus de crecimiento lento y difícil de aislar según los reportes, en este trabajo se logró aislar el hMPV a partir de muestras clínicas frescas, lo cual resulta de gran utilidad en futuros estudios sobre la patogénesis de la infección respiratoria.

Objective: The aim of this work was to establish a laboratory protocol to isolate human metapneumovirus (hMPV) using as a source confirmed respiratory secretion samples from symptomatic patients. Methods: Twelve respiratory secretion samples confirmed for hMPV by immunofluorescence were inoculated on LLCMK2 primate cells using trypsin to improve the virus binding. The cytopathic effect was evaluated during 10 days, then they were stained with an hMPV specific antibody and culture supernatants were used to detect viral RNA by RT-PCR. Results: We isolated hMPV in 8 out of 12 samples. Monkey cells were susceptible to infection and showed viral replication in both immunocytochemistry and molecular tests and even syncytia formation. Conclusion: Despite the hMPV has low replication rates in culture, causing difficulties to isolate it, in this work we accomplish the viral isolation in eight samples that had been previously confirmed containing hMPV. These clinical isolates are a useful tool to study the respiratory infection pathogenesis.

Descripción de un modelo de infección in vitro con virus dengue empleando células mononucleares humanas de sangre periférica / Human peripheral blood mononuclear cells as an in vitro model for dengue virus infection

No existen modelos animales apropiados para el estudio de la fisiopatología y las manifestaciones clínicas de la enfermedad causada por la infección con virus dengue, por lo que para ello se requiere desarrollar modelos experimentales. El propósito del presente trabajo fue establecer un modelo de infección in vitro con virus dengue serotipo-2 (DENV-2). Para esto se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) usando un gradiente de Ficoll, y se las cultivó e infectó con DENV-2 a una baja multiplicidad de infección. La subpoblación celular que se infectó y produjo citocinas se identificó empleando un análisis multiparamétrico por citometría de flujo. Como resultado, las CMSP fueron permisivas a la infección, que se detectó a las 24 horas de inoculado el virus. Además, en este mismo tiempo, los monocitos CD14+, pero no los linfocitos CD3+ o CD19+, fueron la subpoblación celular preferencialmente infectada y responsable de la producción de TNF-α e IL-6. En conclusión, se estableció un modelo de infección in vitro usando CMSP no fraccionadas, en el que se identificó a los monocitos CD14+ como la principal célula blanco de la infección con DENV-2 y productora de citocinas proinflamatorias.

To date, there are no appropriate animal models for the study of the pathophysiology and clinical manifestations of the disease caused by dengue virus infection; therefore, experimental models are required for that purpose. The objective of the present work was to establish a model of in vitro infection with DENV-2. To this end, human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained using a Ficoll gradient, and infected with DENV-2 using a low multiplicity of infection. The cell populations infected and responsible for the production of cytokines were identified using a multiparametric analysis by flow cytometry. As a result, PBMC were permissive to infection that was detected 24 hours after virus inoculation. Additionally, at this same time, CD14+ cells, but not CD3+ or CD19+ cells, were preferentially infected and responsible for the production of TNF-α and IL-6. In conclusion, we established a model of in vitro infection using unfractionated PBMC, in which CD14+ cells were identified as the primary target cells for infection with DENV-2, and the production of proinflammatory cytokines.

Characterization of a murine neuron-enriched model of primary trigeminal ganglia cultures to study the interferon-ß antiviral effect against Herpes Simplex Virus type 1 / Caracterización de un modelo murino de cultivos primarios de ganglio trigeminal enriquecido en neuronas para el estudio del efecto antiviral del interferón-ß frente al virus Herpes simple tipo 1

Objective: To characterize a neuron-enriched primary TG culture and evaluate interferon- β expression and activity after HSV-1 infection. Materials and methods: The percentage of neurons present in cultures was assessed by neurofilament immunocytochemistry. Cultures were treated with interferon- β and infected with HSV-1, then viral antigen positive cells were counted and interferon- βexpression was assessed by quantitative PCR. Results: The culture contained 15% neurons and 85% non-neuronal cells. A cytopathic effect was observed, associated with high viral spread (72.9% neurons and 48.3% non-neuronal cells were positive for viral antigen). Interferon- β treatment impaired the cytopathic effect and decreased the infected neurons to 16.7% and infected non-neuronal cells to 7.8%. Viral infection at 6 h postinfection significantly increased the interferon- β transcripts by 18.2 fold, while at 18 h postinfection Interferon pre-treatment in infected cultures increased interferon- β transcription by 3.7 fold. Discussion: This culture model contained 15% neurons, which is 10 times higher compared to other reported cultures, and non-neuronal cells comprised 85% of cells in this culture. All types of cells were found to be infected, which is similar to that reported during acute infections in vivo . Additionally, interferon- βdecreased the infected cells, avoiding the cytopathic effect, which is similar to that reported in swine TG cultures. Conclusions: A neuron-enriched primary TG model was characterized. Interferon- β treatment protected cells from cytopathic effects and viral spread, while viral infection up-regulated interferon- β expression. This result means that interferon- β exerts an important antiviral effect against HSV-1 in these cultures.

Objetivo: Caracterizar un cultivo primario de ganglio trigeminal (GT) enriquecido en neuronas y evaluar la expresión de interferón- y su actividad frente a la infección con Herpes simple tipo 1 (HSV-1). Materiales y métodos: El porcentaje de neuronas fue determinado por inmunocitoquímica para neurofilamento. Los cultivos fueron tratados con interferón- β e infectados con HSV-1, y se cuantificaron las células positivas para antígeno viral por inmunocitoquímica y la expresión de interferón- β por PCR cuantitativa. Resultados: El cultivo presentó un 15% de neuronas y 85% de células no neuronales. Se encontró efecto citopático, asociado a una alta diseminación de la infección (72,9% neuronas y 48,3% de células no neuronales positivas para antígeno viral). El interferón- β evitó la aparición de efecto citopático y disminuyó las células infectadas a 16,7% en neuronas y a 7,8% las células no neuronales. La infección viral incrementó la expresión de transcritos de interferón- β 18,2 veces a las 6 h de infección, mientras que a las 18 h post infección el tratamiento con interferón incrementó esta expresión 3,7 veces. Discusión: Los cultivos presentaron un 15% de neuronas, lo cual es 10 veces más que en otros cultivos reportados. Las células no neuronales representan el 85% de las células del cultivo, y se evidenció que todos los tipos de células se infectaron; similar a lo que ha sido reportado durante infecciones agudas in vivo . Adicionalmente, el interferón- β disminuyó el porcentaje de células infectadas y evitó la aparición de efecto citopático, similar a lo que ha sido reportado en cultivos de GT porcino. Conclusiones: Se caracterizó un modelo de cultivo primario de GT enriquecido en neuronas. Interferón- β protegió las células del efecto citopático y la diseminación viral mientras que la infección viral incrementó la expresión de interferón- β. Por lo tanto, el interferón- β ejerció un papel antiviral importante frente al HSV-1 en estos cultivos.

Diagnóstico virológico de la infección por virus sincitial respiratorio / Virological diagnosis of respiratory syncytial virus

La enfermedad respiratoria aguda se define como un conjunto de infecciones del tracto respiratorio que pueden ser causadas por una gran variedad de microorganismos tanto virales como bacterianos, y que constituyen un importante problema de salud pública en el mundo. La infección por Virus Sincitial Respiratorio (VSR) está catalogada como una de las principales causas de enfermedad respiratoria aguda, presentándo se especialmente en niños menores de dos años. La falta de diagnóstico confiable de la etiología en las infecciones respiratorias, da como resultado un manejo inadecuado de los pacientes, lo cual puede originar varios tipos de complicaciones. Por tal razón, en esta revisión de la literatura nos enfocamos en presentar un panorama general de la situación de las infecciones respiratorias debidas a VSR en Latinoamérica y las principales dificultades que se presentan al realizar el diagnostico virológico. Para el caso puntual del VSR debido a que todos los agentes etiológicos producen signos y síntomas similares, estos no pueden ser tomados como referencia para distinguir el agente etiológico asociado, así que, en este trabajo se describen las estrategias para realizar el diagnostico de VSR como por ejemplo los que se encargan de detectar anticuerpos específicos en el suero y también los métodos de detección del virus directamente en la muestra de secreción respiratoria, es decir el aislamiento viral en cultivo celular, la detección de antígenos por fluorescencia y la detección de ácidos nucleicos.

Acute respiratory disease is defined as a set of respiratory tract infections that can be caused by a variety of both viral and bacterial microorganisms, which constitute a major public health problem in the world. Respiratory Syncytial Virus (RSV) infection is listed as a major cause of acute respiratory disease, occurring especially in children less than two years old. The lack of accurate diagnosis of respiratory infections etiology, results in an inadequate management of patients, which can cause lots of complications. Thus, this review is focused on presenting an overview of the status of respiratory infections due to RSV in Latin America and the main difficulties related with performing the virological diagnosis. For the specific case of RSV, since all etiologic agents produce similar symptoms, clinical signs cannot be taken as a reference to distinguish the etiological agent of the disease, so, in this paper we describe strategies for diagnosis of RSV such as those that detects specific antibodies in serum and also methods that directly detects the virus in the respiratory secretion sample, in other words, the viral isolation in cell culture, antigens and nucleic acid detection.

Estandarizacion de la tecnica de biopsia para determinacion de fluoruro en esmalte dental / Biopsy technique standardization to determine fluoride content in dental enamel

Introduccion. El fluoruro incorporado en el esmalte dental durante el periodo preeruptivo refleja su exposicion sistemica durante la amelogenesis, proponiendose el esmalte como marcador biologico de exposicion a fluoruros. En Colombia, no existen estudios en que se emplee la tecnica de biopsia de esmalte, la cual permite determinar el gradiente de concentracion de fluoruro por medio de la estructura del esmalte dental. Objetivo. Estandarizar la tecnica de biopsia de esmalte y determinar la concentracion de fluoruro en el esmalte de dientes sanos no erupcionados. Metodos. Previa firma del consentimiento informado, se recolectaron cinco terceros molares no erupcionados sanos y de cada uno se obtuvieron dos bloques de esmalte a partir del tercio medio de la corona, en sentido transversal. Todas las superficies de cada bloque fueron cubiertas con cera, excepto la superficie externa del esmalte. Cada bloque fue tratado con HCl 0,5 M por 15, 30, 60 y 120 segundos bajo agitacion constante. Se determino la concentracion de fluoruro en cada extracto, usando un electrodo de ion especifico para el fluoruro y, la masa de esmalte removido (gramos) se calculo tras el analisis espectrofotometrico de fosforo inorganico en la muestra. Se determino la concentracion de fluoruro en cada capa de esmalte removido (mg F/g de esmalte) y en todo el esmalte removido (¦Ìg F/cm3). Resultados. Se encontro un gradiente de concentracion de fluoruro desde la superficie hacia el interior del esmalte, siendo mayor la concentracion en la superficie (1.663,49¡À266,61 ¦Ìg F/g de esmalte). La concentracion total de fluoruro en el volumen de esmalte removido fue de 1,02¡À0,25 ¦Ìg F/cm3. Conclusiones. La tecnica de biopsia de esmalte fue estandarizada. Similar a lo reportado en la literatura cientifica, existe un gradiente de concentracion de fluoruro desde la superficie hacia el interior del esmalte sano.

Introduction. Pre-eruptive incorporation of fluoride into dental enamel reflects its systemic exposition during amelogenesis, leading to the use of dental enamel as a biomarker of fluoride exposure. There are not reported studies in Colombia using the enamel biopsy technique, which allows the determination of the fluoride distribution pattern throughout dental enamel. Aim. To standardize the enamel biopsy technique and determine the fluoride content in the enamel of sound unerupted teeth. Methods. With ethical approval and informed consent forms, there were collected 5 third unerupted molar-teeth and of each tooth it were obtained two enamel blocks from the middle third of the crown, in a cross-sectional way. All surfaces were covered with acid-resistant wax leaving the external enamel surface exposed, which were treated with 0.5M HCl for 15, 30, 60, and 120 seconds under constant agitation. Fluoride concentration was determined in each acid extract by means of a fluoride ion-specific electrode and the mass of removed enamel was established (grams) after Pi analyses. The fluoride content in each layer of removed enamel was determined (¦Ìg F/g enamel) and in the total of removed enamel (¦Ìg F/cm3). Results: There was a fluoride distribution pattern from the surface to the inner enamel, being higher the fluoride concentration in the outer enamel surface (1663.49 ¡À 266.61 ¦Ìg F/g enamel). Total fluoride concentration in the total of removed enamel was 1.02 ¡À 0.25 ¦Ìg F/cm3. Conclusions: Enamel biopsy technique was standardized. There was found a fluoride distribution pattern from the surface to the inner enamel, similar to the data reported in the literature.

Evaluación del valor diagnóstico de la detección de NS1 en pacientes con dengue agudo / Diagnostic value of NS1 detection in serum from acute dengue patients

El dengue es endemo-epidémico en Colombia y gran parte de nuestra población está en riesgo de padecer esta enfermedad. Uno de los principales problemas en el manejo del dengue es la dificultad para diagnosticar tempranamente esta arbovirosis, ya que la enfermedad presenta un cuadro clínico de evolución inespecífica, por lo cual es indispensable contar con herramientas diagnósticas rápidas y efectivas. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar el valor diagnóstico de la detección de la proteína viral NS1 en pacientes con sospecha de dengue agudo, provenientes del Departamento de Cundinamarca, a quienes previamente se les había realizado detección de IgM en el Laboratorio de Salud Pública de Cundinamarca; de éstos, 44 muestras correspondían a pacientes con una prueba IgM positiva y las otras 44 a pacientes con una prueba de IgM negativa para dengue. A todas las muestras de suero se les practicó la prueba mediante el sistema Pan-E Dengue Early ELISA™ (Panbio) para la detección de NS1. Al hacer el análisis estadístico, se obtuvo una concordancia moderada entre las dos pruebas diagnósticas. Además, se encontró que 40 % de las muestras positivas para NS1, habían sido previamente reportadas como negativas de acuerdo con el resultado de IgM. De igual forma, se encontró enfermedad grave a menor edad y diferencias significativas en la presencia de erupción cutánea, ausencia de diarrea, leucocitos de menos de 4.000 células/μl y menos de 180.000 plaquetas/μl, al comparar los resultados positivos y negativos de cada prueba. Se puede concluir que la determinación de NS1 es necesaria en los casos sospechosos de dengue agudo y, junto con la determinación de IgM, representa un complemento eficiente para el diagnóstico, agilizando la instauración de un tratamiento oportuno.

Dengue is an endemic disease in Colombia and a large part of our population is at risk of suffering from this illness. One of the main problems in the management of dengue is the difficulty to do an appropriate and early diagnosis, because the disease presents an inespecific evolution, thus, it is essential to account on fast and effective diagnostic tools. The present work aimed to evaluate the diagnostic value of detection of the viral protein NS1 in patients with suspected acute dengue, from the Department de Cundinamarca, who had previously been submitted to IgM detection in the Cundinamarca Public Health Laboratory; 44 samples came from patients with a positive IgM test and the other 44 to patients with negative IgM for dengue virus. All serum samples were submitted to Pan Dengue Early ELISA (Panbio) system for NS1 detection. The statistical analysis showed a moderate concordance between the two diagnostic tests. We also found that 40% of positive samples for NS1 had previously been reported as negative according to the results of IgM. Simi1arly, it was found that as younger age, severe disease was present, there were found significant differences in the presence of rash, absence of diarrhea, leukocytes <4000 cel/μl and platelets <180,000/μl when comparing positive and negative results of each test. We can conclude that NS1 determination is needed in suspected cases of acute dengue, and in conjunction with the determination of IgM represents an efficient complement to diagnosis, thus expediting the implementation of early treatment.